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疏水層析是依據蛋白質疏水性差異分離的。即根據蛋白質和疏水介質表面的疏水基團的可逆相互作用進行分離。疏水力在高離子強度下被增強，因此在高離子強度環境中結合，通常采用降低離子強度的方式進行洗脫。獨特的吸附分離模式使得疏水層析成為硫酸銨鹽析后或離子交換高鹽洗脫后理想的純化方式。

疏水相互作用層析（HIC）是純化生物分子工藝中一個功能強大的工具。該技術利用蛋白表面疏水區域和固定相弱疏水性基團之間的相互作用進行層析分離。HIC是離子交換和尺寸排阻層析法的很好的補充，尤其是樣品中存在蛋白異構體，或目標樣品與雜質的等電點或分子量相似而難以分離時使用。在親和填料不易分辨識別位點相似的蛋白時，HIC通過選擇性的差異可以在親和層析之后使用。

生物分子表面大都含有或強或弱的疏水區域，在不同環境下，與各種疏水介質產生不同的強弱和結合。高離子強度可加強疏水性。和離子交換剛好相反，高鹽吸附，低鹽洗脫。經洗脫樣品又可直接或稍加稀釋后上其它層析柱，作為連接下游和層析步驟的橋梁。并可完全取代傳統的鹽析沉淀技術，更符合工業生產要求。 比反相層析介質的配體密度低很多，無需有機溶劑洗脫，保存生物活性。配體種類繁多，提供寬廣的選擇性。疏水層析的分離效果受不同配體、緩沖液、鹽濃度、溫度等多種因素影響。哪種介質最適合很難預測，必須經過試驗。